Evidențierea virusului SARS-CoV-2 (COVID) prin tehnici de amplificare a materialului genetic viral (teste RT-PCR)

Reacția de polimerizare în lanț sau PCR (Polymerase Chain Reaction), este una dintre cele mai cunoscute tehnici din biologia moleculară. Replicarea ADN-ului monocatenar dintr-un șablon folosind primeri și ADN polimerază a fost raportată pentru prima dată încă din anii 1970. Cu toate acestea, metoda PCR pentru a amplificarea ADN-ului țintă, așa cum o cunoaștem astăzi, a fost dezvoltată ca instrument de cercetare în 1983, de către Kary Mullis. De atunci, PCR a devenit o parte integrantă a biologiei moleculare, cu aplicații variind de la cercetarea de bază, la diagnosticarea bolilor și investigații criminalistice. Pentru invenția sa, Kary Mullis a primit Premiul Nobel pentru chimie în 19937.

PCR este un proces biochimic capabil să amplifice o singură moleculă de ADN în milioane de copii într-un timp scurt. Amplificarea se realizează în 3 etape: (1) denaturare, în care șabloanele de ADN dublu catenare sunt separate; (2) aliniere, în care moleculele de ADN scurte numite primeri se leagă de regiunile complementare ale ADN-ului țintă;  (3) elongare, în care ADN polimeraza extinde capătul 3′ al fiecărui primer de-a lungul catenei șablon. Acești pași se repetă de 25–35 de ori pentru a produce în mod exponențial copii exacte ale ADN-ului țintă. Principalele componente ale reacției sunt: ADN-ul matriță, o ADN polimerază termostabilă (Taq polimeraza), primeri oligonucleotidici, deoxinucleotidtrifosfați (dNTP), tamponul de reacție și ioni de Mg2+ 7.​​​

Un test PCR pentru COVID-19 este un test utilizat pentru diagnosticarea persoanelor care sunt infectate în prezent cu SARS-CoV-2. Acesta este testul „standard de aur” pentru diagnosticarea COVID-19, deoarece este cel mai precis și de încredere8.

Există trei pași cheie pentru diagnosticarea COVID-19 prin PCR:

  1. colectarea probelor
    1. extracția
    1. PCR

Vor fi recoltate tampoane de exsudat nazofaringian și orofaringian, conform procedurilor standard.

Exsudatul nazofaringian – Se introduce cu grijă tamponul în nară și se coboară pe planșeul inferior până la nivelul nazofaringelui. În tot acest timp este necesară înclinarea spre spate a capului. După ce se răsucește de 2-3 ori, tamponul se extrage lent9.

Exsudatul orofaringian – Este recomandată recoltarea probelor la cel puțin 4 ore de la toaleta cavității bucale și ingestia de alimente sau lichide. Întregul proces constă în prelevarea probei prin ștergerea amigdalelor și peretelui posterior al faringelui cu tamponul.. Atât la introducerea, cât şi la scoaterea tamponului, se evită atingerea bazei limbii şi a palatului moale9.

Acestea vor fi descărcate în recipientul cu mediu de transport viral, care să asigure viabilitatea virusului8.

ExiPret 16 DX Bioneer pentru detectie virus SARS-CoV-2

Primul pocedeu, după recoltarea probei constă în realizarea procesului de extracție utilizând aparatul ExiPrep™ 16 Dx de la Bioneer, care izolează materialul genetic din eșantion, inclusiv materialul genetic de la orice virus care ar putea fi prezent8.

Pasul următor constă în etapa de PCR, care folosește substanțe chimice speciale și un aparat adecvat numită termociclator – Applied Biosystems QuantStudio 5, care provoacă o reacție ce produce milioane de copii dintr-o mică parte din materialul genetic al virusului SARS-CoV-2. În timpul acestui proces, una dintre substanțele chimice produce o lumină fluorescentă dacă SARS-CoV-2 este prezent în probă. Această lumină fluorescentă este un „semnal” detectat de aparatul PCR și un software special este utilizat pentru a interpreta semnalul ca rezultat pozitiv al testului8.

Deoarece SARS-CoV-2 este un virus de tip ARN (informația genetică e codificată sub formă de acid ribonucleic) este necesară adăugarea enzimei revers-transcriptază, care transformă fragmentele de ARN în secvențele corespunzătoare de ADN. Ulterior, prin procedeul RT-PCR, secvențele ADN sunt multiplicate, astfel încât ating o concentrație suficientă pentru a fi identificate. Ulterior, se adaugă un marker fluorescent, care recunoaște în mod exclusiv secvențe genetice specifice virusului SARS-CoV-2. Astfel, proba este considerată pozitivă dacă apare fluorescența (adică prezența virusului e confirmată de existența secvențelor genetice unice)8.

Sistemul RT-PCR Applied Biosystems QuantStudio 5 este conceput pentru utilizatorii care doresc performanțe superioare, versatilitate și opțiuni de securitate într-un sistem RT-PCR, accesibil și ușor de utilizat. Software-ul de proiectare și analiză optimizat este ideal pentru toți utilizatorii. Când este conectat la iConnect, platforma bazată pe cloud de la Thermo Fisher, sistemul QuantStudio 5 oferă acces la date oriunde și oricând doriți. Folosind tehnologia dovedită OptiFlex (cu șase canale decuplate și LED-uri albe) și cu șase zone de temperatură Veriflex independente, sistemul QuantStudio 5 cu 96 de godeuri permite o precizie ridicată și o sensibilitate îmbunătățită a datelor pentru o gamă largă de aplicații genomice10.

QuantStudio5 - sistem de detecție prezență ARN SARS-CoV-2

Caracteristicile sistemului QuantStudio 5 cu  96 de godeuri includ:

• Tehnologie OptiFlex dovedită (șase canale decuplate / 21 combinații de filtre cu LED alb) pentru rezultate de încredere

• Software-ul securizat bazat pe cloud oferă accesibilitate sporită și opțiuni de stocare

• Software-ul instrumentului este simplificat prezentând ecran tactil interactiv pentru o utilizare simplificată10.

Aplicația prezintă o versatilitate ridicată astfel încât protocoalele sunt simple și optimizate, testele și reactivii fiabili și software-ul intuitiv10.

În probele analizate se adaugă un control ARN intern pentru monitorizarea extracției și amplificării. Un rezultat pozitiv sugerează prezența ARN-ului SARS-CoV-2 în proba supusă analizei. Corelația clinică cu istoricul pacientului și alte informații diagnostice este foarte recomandată pentru a determina starea pacientului. Un rezultat nedetectabil (negativ) indică absența în proba analizată a ARN-ului SARS-CoV-2. În ciuda unui rezultat negativ, nu este exclusă prezența unei infecții cu noul coronavirus, având în vedere calitatea probei prelevate, modul de păstare al acesteia, dar și stadiul infecției. Rezultatele negative trebuie combinate cu observații clinice, istoricul pacientului și informațiile epidemiologice11.

Prezența unor inhibitori ai reacției RT-PCR poate conduce la apariția unui rezultat invalid, observabil prin lipsa amplificării controlului intern. Într-o astfel de situație se recomandă repetarea testului11.

Indiferent pentru care metodă de testare din cadrul laboratorului nostru optați,  noi vă stăm la dispoziție pentru informații și programări la numărul de contact 0330.401.801 sau direct la adresa laboratorului,din str. Nicolae Labiș, nr. 33 (situat la intrare pe serpentine dinspre strada Traian Vuia) de luni până vineri, în intervalul 07:00 – 15:00.